今天凌晨，《纽约时报》等媒体报道美国马里兰大学医学院外科团队在两天前成功为一位终末期心脏病患者移植猪的心脏。患者已安全度过器官移植后最关键的48小时，并计划于美国时间本周二撤除体外循环辅助设备，完全由猪心供血。
这台划时代的心脏移植手术是现代再生医学和基因工程学的胜利。植入人体器官、组织或细胞的同种异体移植物后，不可避免地会引起免疫应答。基因组工程可使异种组织具备下调抗异种免疫应答的能力，有助于跨物种移植。据报道，心脏供者猪的4个基因被敲除或失活，以降低排斥反应、抑制猪心在人体中继续生长，而另有6个人体基因被插入猪基因组，以使猪心耐受人体免疫系统。
《新英格兰医学杂志》（NEJM）在2021年底发表综述《免疫和基因组工程代表可移植组织的未来》，总结了异种（尤其是猪）移植领域的优势、难点、潜在风险和进展。《NEJM医学前沿》在此介绍该文主要内容。
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异种移植——即将到来？
使用其他物种的活体供者作为器官来源优势巨大，但跨物种的免疫应答带来了挑战。基因工程可以克服这一限制。具体而言，通过敲除合成细胞表面碳水化合物异种抗原（GGTG1编码的α-1,3-半乳糖苷酶）机制的编码基因，针对动物器官的超急性免疫应答可基本去除。另外两个基因（CMAH和B4GALNT2，编码生成N-羟乙酰神经氨酸的蛋白质）和SD(a)异种抗原已在敲除模型中被证明降低交叉反应性。
图1. 当前和未来的组织替代策略
传统的组织工程方法（图A）将细胞种植在三维生物材料支架上，后者作为新组织发育的框架（i）。新的细胞外基质分泌后，支架降解（ii），产生所需的有功能的组织（iii）。组织工程移植物（图B）可诱导内源性组织发育。供者组织的细胞种植在支架上（i），成熟组织在生物反应器中产生（ii）。细胞被移除（iii），留下细胞外基质，后者易于储存，可在需要时使用。植入后（iv），细胞迁移到基质中，新组织形成（v）。未来策略（图C）可使用同种异体或异种移植组织来源获得可移植的活器官，或者使用来自组织的脱细胞组织细胞外基质动员内源性修复机制。
与异种移植相关的其他挑战包括与提供器官的动物物种相关的人畜共患病风险，以及患者在社会文化上不愿意接受动物来源的器官。猪通常被认为是人类异种移植理想的潜在器官来源。猪的器官在大小和形状上和人的器官相似，很容易获得，并且近交系和远交系均用于临床前研究。此外，猪可以通过体细胞核移植技术进行克隆，而且它们的基因组现在可以通过工程核酸酶（如锌指核酸酶、TALEN和CRISPR-Cas9系统）进行工程制造（或“编辑”）。最后，与非人灵长类动物相比，猪与人类的关系较远，因此可以推断，猪通过移植器官传播病原体的可能性比非人灵长类动物要小得多。灵敏的PCR可用于检测病原体，我们还需要强有力的监测项目来保持供者动物无病原体。随着不同物种进化距离的增加，氨基酸序列变异形式的“次要抗原”数量必然会增加，因此免疫不相容的可能性也必然会增加。大多数器官由于对糖基化蛋白（如半乳糖-α-1,3-半乳糖）的超急性排斥反应而迅速衰竭，这些蛋白质大量存在于供者动物移植物的细胞膜中。在实验中，使用经基因工程敲除GGTG1（负责初级糖基化活性）的供者猪可大幅减少超急性排斥反应；然而，当这种组织被移植到非人灵长类动物（人类的不完美替代动物）身上之后，它在几周内仍然遭到排斥。研究人员陆续找出了主要编码膜蛋白的CD [分化簇]家族的人类基因，其可表达为转基因蛋白、融合蛋白或者甚至针对猪蛋白的抗体，以进一步减轻人的抗猪免疫应答。在过去10年间，研究人员已经对这些转基因进行了检测，这些转基因编码的蛋白质分为三类：免疫遮蔽（即特定的转基因蛋白干扰NK细胞或T细胞的杀伤作用）、补体人源化和凝血人源化（使用人补体或人凝血途径的特定成分代替或补充猪的对应成分）。研究者已评估了其中一些干预措施在促进非人灵长类动物成功异种移植方面的能力，而且已观察到某些措施显著改善了器官排斥反应。在临床前研究中使用非人灵长类动物的初衷可能是好的，但可能会给临床研究增加不必要的复杂情况。除了这些研究经费和在伦理方面受到的挑战之外，该方法给下面这一本应很简单的问题添加了一个步骤：我们可否通过添加“第三方”物种C（非人灵长类动物）这一测试步骤来提高将器官从供者物种A（猪）移植到物种B（人）的可行性？我们的目的是评估从A移植到B的疗效和安全性，而事实上，非人灵长类动物和人类免疫系统之间的差异（更不用说在大小和生理上的差异）会大幅增加上述评估的复杂程度。“不相关”免疫表型的一个很好的例子是，与人类相比，非人灵长类动物对CMAH敲除猪细胞的糖基化敏感性不同。还有人提出了更激进的想法，使用刚刚死亡的器官供者来评估人类的异种应答。这些举措可能会推动异种移植在临床的实施。
图2. 适合异种移植的哺乳动物物种之间的系统发育关系
异种移植领域的技术进展
过去几年间，异种移植领域取得了两项值得注意的进展。第一项进展是关于猪内源性逆转录病毒序列（PERV）转移到转化的人体组织培养细胞这一安全性问题（在20世纪80年代首次提出）。为了完全消除这一风险，最近使用CRISPR-Cas9技术从PK15猪肾细胞和成纤维细胞的猪基因组中去除了存在的全部62个PERV拷贝（31个位点，每个位点2个拷贝）。另外一组有可能彻底改变异种移植的变革性实验制造出了器官特异性的种间嵌合体（有时被称为“外生”），这为在嵌合动物身上制造完全包含人类细胞的器官创造了巨大的可能性。正如Nakauchi及其同事首先证明的那样，制造胰腺被另一物种的细胞完全取代的嵌合体是可能的。在一项概念验证实验中，研究者将大鼠干细胞引入携带突变（Pdx1-/-）（这一突变可特异性阻止小鼠胰腺的发育）的小鼠胚泡的内细胞群中，进而在小鼠体内制造出了大鼠胰腺。最近，研究者在猪身上也进行了类似实验，但这些实验中的胰腺是被另一谱系的猪的胰腺所取代，而不是被另一物种的胰腺所取代。
图3. 异种移植vs.外生——治疗的概念
图A显示异种移植（人的成分用紫色显示，猪的成分用绿色显示）。猪的基因组经过免疫工程改造，删除猪主要抗原，并且添加可表达某些蛋白质的特定人类转基因，这些蛋白质被证明或推测可改善“异种器官”的持续存活能力。免疫工程的结果（用于异种移植的供者动物）将产生经过免疫工程改造的器官。上图器官是肾，为绿色，因为其中大部分是猪的基因组，但可表达某些人类蛋白或人源化蛋白（紫色圆圈），旨在改善肾在人体内的持续存活能力。异种肾移植到受者体内可恢复功能。图B显示的是外生，其中患者是自体人类干细胞的来源（例如，患者源性iPSC；紫色细胞）。这些细胞被注射到之前经过免疫工程改造（通过删除猪基因、引入人类转基因的方式进行“人源化”）的猪的胚泡内（如图A所示）。外生胚泡产生嵌合体，制造出具有人类基因组的肾脏，即可移植到受者体内。
Nakauchi团队还表明，通过将小鼠iPSC移植到Pdx1-/-大鼠体内，上述种间器官发生可产生自体功能性胰岛。将胰岛移植到诱发糖尿病的等基因小鼠体内。移植的胰岛具有明显功能：移植5天之后，在未使用任何免疫抑制剂的情况下，受者小鼠血液葡萄糖水平恢复正常，且正常血糖水平持续了1年。这以令人信服的方式从概念上证明了如果合适的宿主（可能性最高的是猪或羊，因为它们的器官系统在大小和形状上与人类相似）经过工程改造之后可以将我们的干细胞接纳为自己的细胞，那么外生将在未来得到应用。然而，为了使外生足够安全可行并且具有合理的成本效益，猪和人基因组所需的工程改造程度可能很高，更不用说开发出稳定平台之后所需的大量安全性和有效性检测。展望未来，我们取得的长足进展可能使“传统”异种移植不仅可行，而且实用。研究者已经对所谓的三敲除猪（即敲除GGTA1、CMAH和B4GALNT2）进行了研究，这些猪的细胞表面缺乏通常被正常人血清和外周血单个核细胞识别的碳水化合物异种抗原。据报道，三敲除猪是健康的，并且体外研究表明，相当一部分人可能对这些动物的肾微血管上皮细胞缺乏抗体反应。此外，我们在一些患者样本中观察到的交叉反应性程度与在人同种异体移植物的一些受者中观察到的交叉反应性相似，这提示，在这一患者人群中，他们对来自此类动物的异种移植物的排斥反应有可能通过现有的免疫抑制方案进行控制。对三敲除细胞仍有免疫反应的人类细胞亚群似乎可识别第Ⅰ类猪白细胞抗原（SLA）（相当于MHC Ⅰ）。在随后的研究中，研究者评估了删除猪SLA基因对移植等待名单上患者血清免疫反应性检测结果的影响，结果提示删除上述基因有可能增加受益患者的比例。为了减轻移植后猪器官在人类宿主体内受到的免疫损伤，另一种方法是对补体成分和途径进行工程改造。减轻上述损伤的一种方法是通过表达一种或多种人转基因蛋白（人转基因蛋白可下调人补体活性）的方式将猪表面抗原人源化，之后“遮蔽”猪表面抗原，免于被人免疫系统识别（表1）。因为人补体调节蛋白与人补体途径共同进化，因此预计人蛋白可以比猪蛋白更有效地下调补体效应。这些蛋白质包括CD55（补体衰变加速因子）、CD59（攻膜复合物抑制蛋白）和CD46（补体调节蛋白）。有人提出肿瘤坏死因子α编码基因在控制猪异种移植物的急性血管排斥反应方面也很重要。此外，CD47信号蛋白（能够发送“别吃我”信息39）在促进猪组织被接受方面也很有益。
多个转基因可组合或“堆叠”在单一的许可位点（permissive locus）上，如猪基因组中的Rosa 26。总共使用了9个“堆叠”转基因，其中三组转基因（每组有3个蛋白质编码序列）均与病毒自切2A序列融合并“截断”（punctuated）。每组的3个蛋白质编码序列只需要一个启动子和一个终止子。这些堆叠的转基因与无PERV的三敲除猪基因组结合，经过上述修饰的猪细胞显示出来很有前景的体外特征，包括未发生超急性反应、适当的补体反应，以及未受到人NK细胞和巨噬细胞的破坏。在利用转基因进行人源化方面，目前面临的一个挑战是确定可实现持续、长期表达的启动子和绝缘子序列（即增强子的阻断子或屏障），从而进行进一步开发。Hozain等最近报道了移植领域的另一项跨物种创新，他们将原本认为太过“受损”而无法移植的人肺与猪循环系统相连，并使人肺恢复活力。这样的体外交叉循环使这些受损的肺恢复到足够健康的状态，从而有可能适合移植。这一策略可以大幅增加可用于移植的人肺，否则这些肺将被丢弃而不是移植。
免疫系统——组织修复和移植耐受交汇之处
免疫系统守护着组织和器官的完整性。我们可利用免疫系统实现修复、免疫调节和耐受诱导。组织中的免疫反应可指导感染控制、肿瘤监测、自身免疫和耐受，以及组织修复。1912年，同种异体移植排斥反应中的免疫成分首次在肿瘤和皮肤移植中被观察到。经过大量研究工作，我们针对T细胞依赖性同种异体应答（它对于排斥反应很重要）诱发的急性排斥反应研发出了治疗方法。然而，慢性同种异体移植排斥反应的问题仍未解决，它通常是由从头产生的抗HLA（和其他）抗体介导。预防排斥反应的方法通常是终身使用免疫抑制药物。促进同种异体移植物的免疫耐受，以及在不牺牲免疫系统完整性及其保护作用的前提下消除慢性排斥反应，是目前研究工作的核心。研究者正在对基于细胞的疗法（包括干细胞、Treg和CAR T细胞）开展临床试验，以确定它们在移植中调节免疫应答的能力。免疫系统对于创造促进再生的环境至关重要，这样干细胞和其他组织驻留细胞可以得到支持，从而修复或重建组织。局部驻留和全身输送的免疫细胞（包括嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和T细胞）有助于组织修复过程。一部分Treg（如Foxp3+ CD4+ Treg）与移植和组织修复均相关。Treg分泌可介导组织耐受的免疫抑制因子（如白介素-10、转化生长因子β和白介素-35）。除免疫抑制性细胞因子外，Treg还分泌可动员干细胞并促进组织修复的组织特异性生长因子。为了动员局部干细胞并刺激新组织的发育，Treg在肌肉组织中分泌双调蛋白，在神经组织中分泌胰岛素样生长因子。利用抗原特异性和工程T细胞受体（如CAR Treg）进一步优化移植的Treg细胞群，有可能在未来提高其治效。
图4. 组织移植与修复的交汇
多种免疫细胞有助于组织修复和移植耐受。图中突出显示的T细胞由Treg生成免疫抑制性细胞因子IL10、TGF-β和IL35，通过这一方式促进组织修复和移植耐受，并在伤口分泌组织特异性生长因子。其他T细胞类型（如Th2）通过生成包括IL4在内的细胞因子来促进组织修复。
表1. 转基因蛋白及其在移植中的潜在用途表
Elisseeff J, Badylak SF, Boeke JD. Immune and genome engineering as the future of transplantable tissue. N Engl J Med 2021; 385:2451-2462.